Дипломная работа на тему "Нарушение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможная причина изменения структуры протеогликанов в опухоли молочной железы человека"

ГлавнаяМедицина, здоровье → Нарушение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможная причина изменения структуры протеогликанов в опухоли молочной железы человека




Не нашли то, что вам нужно?
Посмотрите вашу тему в базе готовых дипломных и курсовых работ:

(Результаты откроются в новом окне)

Текст дипломной работы "Нарушение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможная причина изменения структуры протеогликанов в опухоли молочной железы человека":


Новосибирский Государственный Университет

Факультет Естественных Наук

Кафедра Молекулярной Биологии

Дипломная работа

Нарушение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможная причина изменения структуры протеогликанов в опухоли молочной железы человека

Бородина Анастасия Вячеславовна

Научные руководители:

к. б. н. Рыкова В. И., с. н. с. лаборатории Структуры генома ИЦиГ СО РАН.

к. б. н. Григорьева Э. В., с. н. с. лаборатории Молекулярных механизмов канцерогенеза Института Молекулярной Биологии и Биофизики СО РАМН.

Работа выполнена в лаборатории Структуры генома ИЦиГ СО РАН и лаборатории Молекулярных механизмов канцерогенеза Института Молекулярной Биологии и Биофизики СО РАМН

Новосибирск-2009


Содержание

Содержание

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Протеогликаны

1.2 Отличие протеогликанов от гликопротеинов

1.3 Классификация протеогликанов

Заказать написание дипломной - rosdiplomnaya.com

Специальный банк готовых оригинальных дипломных работ предлагает вам написать любые работы по требуемой вам теме. Качественное написание дипломных работ по индивидуальному заказу в Нижнем Новгороде и в других городах РФ.

1.4 Строение и классификация гликозаминогликанов

1.5 Присоединение цепей ГАГ к коровому белку

1.6 Гиалуроновая кислота

1.7 Хондроитинсульфат протеогликаны

1.8 Дерматансульфат протеогликаны

1.9 Гепарансульфат протеогликаны и гепарин

1.10 Кератансульфат протеогликаны

1.11 Биосинтез протеогликанов

1.12 Обмен протеогликанов

1.13 Локализация и функции протеогликанов

1.14 Состав протеогликанов в трансформированных клетках

1.14.1 Декорин

1.14.2 D-глюкуронил С5-эпимераза

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы

2.1.1 Операционный материал

2.1.2 Антитела

2.2 Методы

2.2.1 Выделение протеогликанов

2.2.2 Очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот

2.2.3 Идентификация протеогликанов

2.2.4 Аналитические методы

2.2.5 Вестерн-блот

2.2.6 Электрофорез

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Выделение протеогликанов

3.2 Отработка условий проведения электрофореза протеогликанов в агарозном геле

3.3 Очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот

3.3.1 Обработка препаратов протеогликанов щелочью

3.3.2 Обработка препаратов протеогликанов нуклеазами

3.4 Сравнение состава протеогликанов в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека

3.5 Количественная оценка протеогликанов

3.6 Идентификация фракций протеогликанов

3.6.1 Обработка препаратов протеогликанов специфическими ферментами

3.6.2 Обработка препаратов протеогликанов азотистой кислотой

3.7 Определение экспрессии декорина в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека

3.8 Определение экспрессии белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека

Заключение

Список литературы


Список сокращений

АТ - антитела

ВКМ - внеклеточный матрикс

ГАГ - гликозаминогликаны

ГС - гепарансульфат

Ге - гепарин

ГК - гиалуроновая кислота

ДС - дерматансульфат

КС - кератансульфат

НК - нуклеиновые кислоты

ПААГ - полиакриламидный гель

ПГ - протеогликаны

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ХС - хондроитинсульфат

Эпимераза - D-глюкуронил С5-эпимераза

Ac - ацетил

Gal - галактоза

GalN - галактозамин

GlcN - глюкозамин

GlcUA - глюкуроновая кислота

IdoUA - идуроновая кислота

Fuc - фукоза

Man - манноза

SA - сиаловая кислота

Xyl - ксилоза


Введение

Проблема регуляции клеточной пролиферации является одной из ключевых проблем биологии. Нарушения в регуляции деления клеток приводят к изменению их митотической активности, что влечет за собой возникновение различных патологических состояний, в том числе злокачественную трансформацию.

В регуляции клеточного деления принимают участие различные биологические молекулы, в том числе и сложные белково-углеводные молекулы - протеогликаны.

Известно, что определенные представители протеогликанов обладают антимитотической активностью. В нашей группе было показано, что состав и количество протеогликанов в трансформированных клетках меняется. В опухолевых тканях, наряду с общим увеличением количества протеогликанов, снижается содержание дерматансульфат протеогликанов, характерных для покоящихся клеток, и возрастает содержание хондроитинсульфат протеогликанов, характерных для эмбриональных и активно пролиферирующих тканей. Были получены данные, что протеогликаны являются тканеспецифичными, но не видоспецифичными ингибиторами деления клеток и привлекают внимание как регуляторы клеточной пролиферации, в том числе как перспективные ингибиторы роста злокачественных опухолей.

Для некоторых протеогликанов, в частности, для декорина (дерматансульфат протеогликана), показан механизм антипролиферативного действия (через усиление экспрессии р21-белка и подавление активности циклин-зависимых киназ). Было показано, что в опухолевых клетках содержание декорина уменьшается. Добавление экзогенного декорина или генноинженерных конструкций, содержащих ген декорина, в культуру опухолевых клеток приводило к возвращению опухолевых клеток к нормальному фенотипу. Однако вопрос о причинах уменьшения содержания декорина в опухолевых клетках до сих пор не поднимался.

Нашей группой было выдвинуто предположение, что возможно, в опухолевых клетках происходят изменения в процессе биосинтеза протеогликанов.

Известно, что ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфат протеогликанов является D-глюкуронил С5-эпимераза - фермент, осуществляющий модификацию углеводной цепи хондроитинсульфата в дерматансульфат. Нарушение экспрессии или изменение активности фермента D-глюкуронил С5-эпимеразы может служить причиной изменения соотношения хондроитинсульфатов и дерматансульфатов в тканях - уменьшению количества зрелого дерматансульфата (в том числе и декорина).

Для проверки этой гипотезы требуется провести параллельное определение состава протеогликанов и уровня экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы в одних и тех же образцах нормальной и опухолевой ткани. В качестве объекта исследования нами выбрана нормальная и опухолевая ткань молочной железы человека.

Данная дипломная работа посвящена определению состава протеогликанов и экспрессии белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.


Глава 1. Обзор литературы 1.1 Протеогликаны

Протеогликаны (ПГ) - это семейство сложных макромолекулярных соединений, состоящих из белкового кора и ковалентно присоединенных к нему углеводных цепей - гликозаминогликанов (ГАГ) (рис.1).

Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

Рис.1. Структура протеогликана аггрекана

1.2 Отличие протеогликанов от гликопротеинов

Еще недавно бытовало общепринятое разделение: гликопротеин - гликозилированный белок, протеогликан - углеводная молекула с небольшой белковой частью. Это разделение слишком неопределенное.

Существуют более четкие отличительные параметры, позволяющие выделить портеогликаны в обособленный класс белково-углеводных молекул.

Протеогликан - это гликопротеин, к которому присоединены углеводные цепи ГАГ. Гликозаминогликаны являются регулярными (повторяющиеся дисахаридные единицы), неразветвленными, высокозаряженными полимерами. Они присоединяются к коровому белку через кислород остатков серина (за некоторым исключением) - - гликозилирование. В то время как гликопротеины, к которым относится большинство белков, модифицированы углеводными цепями, не имеющими регулярного строения, эти цепи зачастую не являются линейными (имеют ветвления) и либо состоят из нейтральных моносахаров, либо несут незначительный заряд. Олиго - или полисахаридные цепи в гликопротеинах присоединяются к полипептидным цепям через кислород остатков серина или (чаще) азот остатков аспарагина (О - или - гликозилирование).

К тому же цепи ГАГ значительно превосходят по длине углеводные цепи гликопротеинов. Например, цепь ГАГ с молекулярным весом 20 кДа содержит около 50 остатков сахаров, в то время как типичный N-гликан содержит 10-12 остатков.

Протеогликаны могут нести на своем коровом белке помимо ГАГ-цепей также короткие нерегулярные олигосахариды. При этом свойства сложной молекулы определяются в основном типом ГАГ-цепи, хотя олигосахариды могут также влиять на биологическую активность.

Если к гликопротеину присоединена хотя бы одна цепь ГАГ, он является протеогликаном.

1.3 Классификация протеогликанов

Классифицируют протеогликаны по типу доминантных цепей ГАГ, присоедненных к коровому белку.

1.4 Строение и классификация гликозаминогликанов

Гликозаминогликаны представляют собой линейные гетерополисахариды, составленные из повторяющихся дисахаридных единиц, каждая из которых состоит из гексозамина (D-глюкозамина - GlcN или D-галактозамина - GalN), соединенного с гексуроновой кислотой (D-глюкуроновой - GlcUA, или L-идуроновой - IdоUA), присутствующей во всех ГАГ, за исключением кератансульфата, где она замещена остатками галактозы (Gal).

Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле. Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле. Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

Дисахаридные единицы могут быть N - и O-сульфатированы и/или ацетилированы. Степень сульфатирования ГАГ намного выше, чем других макромолекул и достигает 3-4 сульфатных групп на дисахарид.

Благодаря сульфатным и карбоксильным группам ГАГ имеют очень высокую плотность отрицательного заряда, что во многом определяет их биологические свойства и регулирует их взаимодействие с другими молекулами.

В зависимости от структуры дисахарида, а также степени сульфатирования, все ГАГ разделяют на несколько классов: гиалуроновая кислота (ГК), хондроитинсульфаты (ХС), дерматансульфаты (ДС), гепарансульфаты (ГС), гепарин (Ге), кератансульфаты (КС) (таблица 1 и рис.2). Зачастую на одном белковом коре находятся разные типы ГАГ-цепей.

Таблица 1. Классы гликозаминогликанов (ГАГ)

--------------------------------------------------
Класс ГАГ | Мол. Вес, кДа | Повторяющаяся дисахаридная единица | Сульфогруппа (O-, N-связанная) | Количество сульфо-групп на 1 дисахарид | Другие сахара, встречаю-щиеся в связующем участке |
---------------------------------------------------------
Гиалуроновая кислота, ГК | 1-8000 |

D-GlcUA,

D-GlcN

| - | - | - |
---------------------------------------------------------

Хондроитин-

сульфат, ХС

| 10-50 |

D-GlcUA,

D-GalN

| O- | 0,1-1,3 | D-Gal, D-Xyl |
---------------------------------------------------------
Дерматан-сульфат, ДС | 10-40 |

D-GlcUA/

L-IdоUA, D-GalN

| O- | 1-2,5 | D-Gal, D-Xyl |
---------------------------------------------------------
Гепаран-сульфат, ГС | 10-40 | D-GlcUA/L-IdоUA, D-GlcN | O-, N- | 0,4-2,0 | D-Gal, D-Xyl |
---------------------------------------------------------
Гепарин, Ге | 5-25 | D-GlcUA/L-IdоUA, D-GlcN | O-, N- | 1,5-3,0 | D-Gal, D-Xyl |
---------------------------------------------------------
Кератан - сульфат I, KC I | 5-25 | D-Gal, D-GlcN | O- | 0,9-1,8 | D-Man, L-Fuc, SA |
---------------------------------------------------------
Кератан - сульфат II, KC II | 5-15 | D-Gal, D-GlcN | N- | 0,9-1,8 | D-GalN, SA |
--------------------------------------------------------- --------------------------------------------------

Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

Рис.2. Структура дисахаридов, образующих цепи ГАГ различных классов


1.5 Присоединение цепей ГАГ к коровому белку

Цепи большинства ГАГ присоединяются к остатку серина корового белка через тетрасахаридный линкер: - Xyl-Gal-Gal-GlcUA-, далее следуют соответствующие чередующиеся дисахаридные единицы (рис.3). ГАГ-цепи присоединяются к остаткам серина определенных ГАГ-акцепторных сайтов на коровом белке: "-A-Ser-Gly-X-Gly-", где А - кислая аминокислота, а Х - точно не определена [1]. Дипептид Ser-Gly в последовательности акцепторного сайта белка является основным требованием для узнавания ферментом ксилозилтрансферазой, переносящим остаток ксилозы на серин [2].

Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

Рис.3. Структура линкерного района протеогликанов

У кератансульфат протеогликанов линкерный район имеет разветвленное строение. Цепи ГАГ присоединяются к коровому белку либо через остаток аспарагина (N-гликозилирование) - КС I (рис.4), либо через остаток серина/треонина (О-гликозилирование) – КС II.

Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

Рис.4. Структура линкерного района кератансульфат протеогликанов

1.6 Гиалуроновая кислота

Повторяющаяся дисахаридная единица гиалуроновой кислоты - GlcNAc-GlcUA. ГК широко распространена в природе, от капсул Streptococcus до тканей беспозвоночных и позвоночных организмов [3]. У млекопитающих ГК присутствует в коже, скелетной ткани, стекловидном теле глаза, пупочном канатике и синовиальной жидкости [4].

Типичный полимер может содержать 104 дисахаридных единиц (от 105 до107 Да) [5].

В растворе ГК имеет вытянутую структуру - будучи растянутым, полимер 106 Да имеет длину около 2 мкм. Благодаря своей длине, молекулы ГК стремятся образовать запутанную ситоподобную структуру. При концентрации 10 мг/мл вязкость (η) ГК составляет 5000 (т. е. в 5000 раз превышает вязкость воды), что придает упругость тканям, в которых гиалуроновая кислота присутствует в высокой концентрации (гребень петуха, стекловидное тело и др.). ГК является биологическим любрикантом - уменьшает трение при движении и обеспечивает упругость в статических условиях, участвует в поддержании гомеостаза воды, является своего рода фильтром и регулирует распределение белков плазмы [3].

Поскольку ГК имеет однородную структуру, может показаться, что она не принимает участия в специфических взаимодействиях. Однако это не так: обнаружена группа белков (гиаладгеринов), специфично узнающих структуру ГК. Такого типа взаимодействия связывают ГК с протеогликанами, стабилизируя структуру внеклеточного матрикса, и с клеточными поверхностями, изменяя поведение клеток [3].

Биосинтез ГК представляет собой кополимеризацию GlcNAc и GlcUA, донорами которых выступают высокоэнергетические нуклеотидные предшественники: UDP-GlcNAc и UDP-GlcUA, соответственно. В отличие от остальных гликозаминогликанов, ГК никогда ковалентно не присоединяется к белку. Биосинтез ГК происходит в плазматической мембране, что является исключением из правила, гласящего, что гликозилирование осуществляется в аппарате Гольджи [5, 6].

Катаболизируется ГК в лизосомах после рецептор-опосредованного эндоцитоза, на месте или же (после транспорта с током лимфы) в лимфатических узлах, где деградируется основная доля ГК [3].

1.7 Хондроитинсульфат протеогликаны

Хондроитинсульфаты представляют собой линейные полимеры, состоящие из повторяющихся дисахаридных единиц GalNAc-GlcUA. В составе ДС-цепей присутствуют также остатки IdoUA (вместо GlcUA) в различных пропорциях. Количество дисахаридов в составе ХС-цепи варьирует от 40 до 100 и более штук.

Выделяют 6 классов ХС, в соответствии со структурой дисахаридных единиц: ХС А, ХС В (ДС), ХС С, ХС D, ХС Е и ХС iE (i-идуроновая кислота) (рис.5).

Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

Рис.5. Шесть типичных дисахаридных единиц, обнаруженных в ХС и ДС

Огромное структурное разнообразие ХС и ДС, сравнимое с таковым у гепарансульфатов, обеспечивается включением в состав ГАГ-цепей дисахаридных единиц различной структуры и сульфатированных по различным положениям.

Такое структурное разнообразие лежит в основе широкого круга функций. ХС и ДС принимают участие в регуляции таких фундаментальных процессов, как рост, развитие, клеточная пролиферация, модулируя активность факторов роста.

ХС и ДС специфично взаимодействуют с гепарин-связывающими белками. Взаимодействия ДС-цепей с факторами роста фибробластов (FGF-2 и FGF-7) регулируют клеточную пролиферацию и заживление ран, а взаимодействия ДС с фактором роста гепатоцитов (HGF/SF) активируют HGF/SF-сигнальный путь через рецептор этого фактора роста (c-met-протоонкоген). ХС/ДС-протеогликан эндокан, секретируемый эндотелиальными клетками, стимулирует HGF/SF-индуцированную клеточную пролиферацию. Поскольку HGF/SF играет важную роль в процессах морфогенеза, органогенеза, дифференцировки и ангиогенеза во многих типах клеток, то нарушения во взаимодействиях HGF/SF с его рецептором или же с предполагаемым корецептором ДС может привести к образованию опухоли и ее метастазированию.

ХС-цепи сходным образом взаимодействуют и с другими гепарин-связывающими белками. ХС/ДС-цепи протеогликана версикана, который экспрессируется в почках, коже, аорте, мозге, связываются, наряду с хемокинами, с адгезивными молекулами L - и P-селектинами. Все три типа молекул вовлечены в регуляцию движения лимфоцитов и резвитие воспалительных процессов [7].

Основные представители ХСПГ приведены в таблице 2.

Таблица 2. Примеры хондроитинсульфат протеогликанов

--------------------------------------------------
Протеогликан | Коровый белок, кДа | Количество цепей | Ткань |
---------------------------------------------------------
Аггрекан | 208-220 | ~100 | cекретируемый, хрящ |
---------------------------------------------------------
Версикан | 265 | 12-15 | cекретируемый, фибробласты |
---------------------------------------------------------
Нейрокан | 145 | 1-2 | cекретируемый, мозг |
---------------------------------------------------------
Бревикан | 96 | 0-4 | cекретируемый, мозг |
---------------------------------------------------------
Декорин | 36 | 1 | cекретируемый, клетки соединительной ткани |
---------------------------------------------------------
Бигликан | 38 | 1-2 | cекретируемый, клетки соединительной ткани |
---------------------------------------------------------
Бамакан | 138 | 1-3 | базальные мембраны |
---------------------------------------------------------
α2 (IX) коллаген | 68 | 1 | хрящ, стекловидное тело |
---------------------------------------------------------
Тромбомодулин | 58 | 1 | эндотелиальная мембрана |
---------------------------------------------------------
CD44 | 37 | 1-4 | лимфоциты, мембранный |
---------------------------------------------------------
NG2 | 251 | 2-3 | нейральные клетки, мембранный |
---------------------------------------------------------
Инвариантная цепь | 31 | 1 | антиген-презентирующие клетки |
---------------------------------------------------------
Серглицин | 10-19 | 10-15 | миелоидные клетки, гранулы |
--------------------------------------------------------- --------------------------------------------------
1.8 Дерматансульфат протеогликаны

ДС, также называемые хондроитинсульфатами В (ХСВ), состоят из дисахаридных единиц D-GlcUA (L-IdоUA) - D-GalNАс. ДС относят к хондроитинсульфатам благодаря присутствиюв нихGalNAc, но из-за присутствия IdоUA их выделяют в отдельный класс ХС.

Дерматансульфат может быть рассмотрен как изомер ХС, в котором D-глюкуроновая кислота превращена в L-идуроновую. Однако полной эпимеризации всех остатков GlcUA, как правило, не происходит. Таким образом, цепи ДС являются гибридными молекулами с разными последовательностями.

Формирование L-IdoUA происходит путем С5-эпимеризации GlcUA, уже вошедшей в растущий полимер. Количество L-IdoUA в цепи варьирует в широких пределах - от нескольких процентов до 90% всей идуроновой кислоты. Среднее количество сульфатных групп на дисахарид в ДС выше, чем в ХС, что связано с наличием двух сульфатных групп у некоторых остатков L-IdoUA.

IdоUA играет ключевую роль в формировании на ГАГ сайтов посадки различных ГАГ-связывающих белков. Подтверждением этого служит тот факт, что ГАГ-цепи, содержащие значительные количества остатков IdоUA, ингибируют пролиферацию нормальных фибробластов, в отличие от ГАГ с высоким содержанием остатковGlcUA.

Дерматансульфаты изучены значительно хуже других типов гликозаминогликанов. Впервые ДС были выделены из дермы, что и обусловило их название. ДС обнаружены и во многих других тканях. В высоких концентрациях они присутствуют в волокнистой соединительной ткани (в коже, сухожилиях, стенке кровеносных сосудов). ДС преобладают в коже и выделяются в высоких концентрациях в процессе заживления ран.

протеогликан белковая молекула опухоль

ДС выполняют множество функций, обеспечивая гибкое регулирование нормальных и патологических процессов, таких как развитие, рост, заживление ран, инфекция и опухолевый рост.

Различия в длине ГАГ-цепи ДС, различное положение остатков IdоUA, вариации в сульфатировании и существование множества альтернативных форм коровых белков обеспечивают огромное разнообразие и сложность ДС и ДСПГ.

Существует множество доказательств того, что различия в длине ГАГ-цепей, составе дисахаридов и сульфатировании определяют силу связывания различных факторов и регулируют функциональные взаимодействия ДС с потенциальными белковыми лигандами.

ДС модифицируются путем сульфатирования по С4 - и С6 - атомам гексозамина (как и ХС А и ХС С) и эпимеризации С2-атома уроновой кислоты (как ГС и Ге). Оба процесса контролируются регулируемыми ферментативными системами так, что в итоге в структуре ГАГ оказывается закодированной функциональная информация.

Таким образом, для ДС информационная последовательность состоит из трех вариаций структуры уроновой кислоты (GlcUA, IdoUA или 2-O-сульфатированная IdoUA) и четырех вариаций структуры гексозамина (GalNAc, 4-O-сульфатированный GalNAc, 6-O-сульфатированный GalNAс, 4-O - и 6-O-дисульфатированный GalNAc). Также в дальнейшем (при образовании протеогликана) на информационную последовательность ДС оказвает влияние тип корового белка, специфичного к данной стадии развития и к данным физиологическим условиям.

Два наиболее изученных дерматансульфат протеогликана - маленькие лейцин-богатые ПГ декорин и бигликан. Оба протеогликана содержат маленький белковый кор, оба являются секретируемыми матриксными белками. Декорин и бигликан несут 1 и 1-2 ДС-цепи, соответственно.

ДСПГ взаимодействуют со множеством молекул, таких как молекулы внеклеточного матрикса, факторы роста, ингибиторы протеаз, цитокины, хемокины, факторы вирулентности патогенов и др. Некоторые из этих молекул приведены в таблице 3.

Tаблица 3. Связывание ДС и ДСПГ с различными молекулами

--------------------------------------------------
Белок |

ГАГ

|

Последовательность для связывания

|

Физиологический эффект

|
---------------------------------------------------------
Кофактор гепарина II | ДС, Ге |

IdoUA (2-OSO3) - GalNAc (4-OSO3) гексосахарид

| Ферментативная инактивация тромбина |
---------------------------------------------------------
Тромбин | ДС, Ге | - | Предовращение свертывания крови |
---------------------------------------------------------
Активированный C-белок | ДС, Ге | - | Предовращение свертывания крови |
---------------------------------------------------------
Ингибитор С-белка | ДС, ГС, Ге | - | Стимуляция активности серпина |
---------------------------------------------------------
Тромбоцитарный фактор 4 | ДС, Ге | - | - |
---------------------------------------------------------
Коллаген | ДС | Связывается коровый белок | Стимуляция активности серпина |
---------------------------------------------------------
Фибронектин | ДС, ГС | Связывается коровый белок | Стабилизация внеклеточного матрикса |
---------------------------------------------------------
Tенаскин-X | ДС, ГС | Связывается ГАГ-цепь | Стабилизация коллагенового матрикса |
---------------------------------------------------------

Адгезины Borrelia burgdorferi

| ДС | - | Увеличение инфекционности |
---------------------------------------------------------

Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.-дефензин

| ДС | - | Увеличение инфекционности |
---------------------------------------------------------

Интерферон-Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

| Ге, ГС, ДС | - |

Рецептор для INF-Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

|
---------------------------------------------------------
Трансформирующий фактор роста-b | ДС | Связывается коровый белок | Регуляция роста |
---------------------------------------------------------
Факторы роста фибробластов 1 и 2 | Ге, ГС, ДС | - | Клеточная пролифереция через активацию тирозинкиназы |
---------------------------------------------------------
Фактор роста гепатоцитов | ДС, ГС |

IdoUA-GalNAc (4-OSO3) октосахарид для ДС

| Клеточная пролиферация, органогенез, опухолевый рост |
---------------------------------------------------------
Липопротеин низкой плотности | ДС | - | Стабилизация атеросклеротической бляшки |
--------------------------------------------------------- --------------------------------------------------

- нет данных.

Подробно функции ДСПГ описаны в обзоре [8].

1.9 Гепарансульфат протеогликаны и гепарин

ГС и Ге - структурно родственные ГАГ с повторяющимися дисахаридными единицами GlcNAcα1-4GlcAβ1-4. Однако между ними существуют значительные различия, важнейшие из которых приведены в таблице 4.

Таблица 4. Основные различия между гепарансульфатами и гепарином

--------------------------------------------------
Характеристика | Гепарансульфат | Гепарин |
---------------------------------------------------------
Растворимость в 2 М ацетате калия (pH 5.7, 4°C) | да | нет |
---------------------------------------------------------
Размер | 10-70 кДа | 10-12 кДа |
---------------------------------------------------------
сульфат/гексозамин | 0.8-1.8 | 1.8-2.4 |
---------------------------------------------------------
GlcN N-сульфаты | 40-60% | ≥85% |
---------------------------------------------------------
Содержание IdoUA | 30-50% | ≥70% |
---------------------------------------------------------
Связывание с антитромбином | 0-0.3% | ~30% |
---------------------------------------------------------
Место синтеза | практически все клетки | тучные клетки |
--------------------------------------------------------- --------------------------------------------------

Гепарин синтезируется в тучных клетках и запасается в цитоплазматических гранулах. Он продается фармацевтическими компаниями как антикоагулянт. ГС, синтезирующиеся практически всеми типами клеток, также обладают антикоагуляционной активностью, однако в значительно меньшей степени, чем гепарин. В процессе биосинтеза гепарин значительно сильнее сульфатируется, в итоге более 85% остатков GlcNAc оказываются N-деацетилироваными и N-сульфатированными. И более 70 % остатков уроновой кислоты в гепарине претерпевает эпимеризацию [9].

Гепарин имеет самую высокую плотность отрицательного заряда среди известных биологических макромолекул. Это дает ему возможность осуществления ионных взаимодействий со множеством белков, таких как ферменты, ингибиторы ферментов, белки внеклеточного матрикса, различные цитокины и др. Такого рода взаимодействия используются при очистке гепарин-связывающих белков, которые сорбируются на иммобилизованном гепарине при низкой ионной силе, а затем элюируются солевым раствором.

Гепарин выделяют на коммерческой основе из тканей животных (из слизистой кишечника свиней, легкого коров). Он используется в клинике как антитромболитическое лекарство.

Гепарансульфаты широко распространены на поверхности всех типов клеток, а также во внеклеточном матриксе. ГС взаимодействуют с различными белками, тем самым участвуя в широком спектре физиологических процессов, таких как клеточная адгезия, ферментативная регуляция, действие цитокинов и др. [10]

Примеры гепарансульфат протеогликанов приведены в таблице 5.

Таблица 5. Примеры гепарансульфат протеогликанов

--------------------------------------------------
Протеогликан | Коровый белок, кДа | Количество цепей | Ткань |
---------------------------------------------------------
Перлекан | 400 | 1-3 ГС | базальные мембраны |
---------------------------------------------------------
Агрин | 212 | 2-3 ГС | базальные мембраны |
---------------------------------------------------------
Синдеканы1-4 | 31-45 | 1-3 ХС, 1-2 ГС | эпителиальные клетки и фибробласты |
---------------------------------------------------------
Бетагликан | 110 | 1 ГС, 1 ХС | фибробласты |
---------------------------------------------------------
Глипиканы1-5 | ~60 | 1-3 ГС | эпителиальные клетки и фибробласты |
---------------------------------------------------------
Серглицин | 10-19 | 10-15 гепарин/ХС | тучные клетки |
--------------------------------------------------------- --------------------------------------------------
1.10 Кератансульфат протеогликаны

Повторяющаяся дисахаридная единица КС - Gal-GlcNAc.

По способу присоединения ГАГ-цепи к коровому белку кератансульфаты делят на два типа (см. п.1.5.). Кератансульфаты первого типа представлены в роговице, второго типа - в скелетной ткани.

Примеры кератансульфат протеогликанов приведены в таблице 6.

Таблица 6. Примеры кератансульфат протеогликанов

--------------------------------------------------
Протеогликан | Тип | Масса корового белка, кДа | Распространение |
---------------------------------------------------------
Люмикан | KS I | 37 | широкое |
---------------------------------------------------------
Кератокан | KS I | 37 | широкое, но сульфатирован только в роговице |
---------------------------------------------------------
Фибромодулин | KS I | 59 | широкое |
---------------------------------------------------------
Мимекан | KS I | 25 | широкое, но сульфатирован только в роговице |
---------------------------------------------------------
SV2 | KS I | 80 | синаптические пузырьки |
---------------------------------------------------------
Клаустрин | KS II | 105 | ЦНС, мембранный ПГ |
---------------------------------------------------------
Аггрекан | KS II | 200 | хрящ |
--------------------------------------------------------- --------------------------------------------------

В роговице КСПГ выполняют чрезвычайно важную функцию - поддерживают одинаковое расстояние между фибриллами коллагена I типа, позволяя, таким образом, свету проходить, не рассеиваясь. Дефекты в сульфатировании (макулярная роговичная дистрофия) или формировании КС-цепи (кератоконус) влекут за собой изменения в организации фибрилл, что в свою очередь приводит к непрозрачности роговицы [11, 12].

Цепь КС I может быть довольно протяженной (~50 дисахаридных единиц, 20-25 кДа) и содержит смесь несульфатированных, моносульфатированных (Gal-GlcNAc6S) и дисульфатированных дисахаридов (Gal6S-GlcNAc6S). По крайней мере, две сульфотрансферазы - GlcNAc 6-O-ST и Gal 6-O-ST - катализируют реакции сульфатирования КС [12, 13]. Сульфатные группы КС важны для биологической функции данных молекул. Это подтверждается данными о том, что степень сульфатирования КС увеличивается во время развития роговицы в эмбриогенезе, а синтез несульфатированных КС приводит к макулярной роговичной дистрофии [12].

Катаболизм КС. Бактериальные кератаназы расщепляют цепь КС по определенным позициям (таблица 7).

Таблица 7. Кератаназы

--------------------------------------------------
Фермент | Специфичность |
---------------------------------------------------------

Эндо-β-галактозидаза (Flavobacterium)

| Gal-GlcNAc, не работает на сульфатированных остатках |
---------------------------------------------------------

Кератаназа I (Pseudomonas species) (эндо β-галактозидаза)

| Gal-GlcNAc6S |
---------------------------------------------------------
Кератаназа II (Грам-отрицательные бактерии) (эндо - β-глюкозаминидаза) | GlcNAc-Gal6 ± S |
--------------------------------------------------------- --------------------------------------------------

У животных КС расщепляются в лизосомах путем последовательного действия экзогликозидаз (β-галактозидаз и β-гексозаминидаз) после удаления сульфатных групп с концевого остатка сульфатазами [14].

1.11 Биосинтез протеогликанов

Биосинтез и распад гликозаминогликанов осуществляется при участии высокоспецифичных ферментов - гликозилтрансфераз, гликозидаз и сульфатаз в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) и аппарате Гольджи.

Биосинтез ГАГ начинается с синтеза тетрасахаридного линкера, затем происходит полимеризация ГАГ-цепи.

Основные ферменты, участвующие в синтезе тетрасахаридного линкерного района, указаны в таблице 8.

Таблица 8. Основные ферменты синтеза тетрасахаридного линкера протеогликанов

--------------------------------------------------
Фермент | Субстрат |
---------------------------------------------------------
Ксилозилтрансфераза | XylT | . D/E. SG. D/E |
---------------------------------------------------------
Галактозилтрансфераза-I | GalT-I | Xyl-Ser |
---------------------------------------------------------
Галактозилтрансфераза-II | GalT-II | Gal-Xyl-Ser |
---------------------------------------------------------
Глюкуронилтрансфераза-I | GlcAT-I | Gal-Gal-Xyl-Ser |
--------------------------------------------------------- --------------------------------------------------

Синтез тетрасахаридного линкерного района начинается в ЭПР с переноса ферментом О-ксилозилтрансферазой (XylT) остатка ксилозы от UDP-ксилозы на остаток серина корового белка [15]. Последующее добавление двух остатков галактозы, производимое двумя различными галактозилтрансферазами (GalТ-I и GalТ-II), происходит в начальных/cредних отделах аппарата Гольджи. Донором остатков галактозы выступает UDP-галактоза. Одна гликозилтрансфераза образует β-1,3-, а другая - β-1,4-гликозидную связь [16]. Затем фермент глюкуронилтрансфераза-1 (GlcAT-I) завершает синтез линкерного участка, присоединяя глюкуроновую кислоту [16].

Сразу же после синтеза тетрасахаридный район может быть модифицирован: фосфорилирован по С-2 ксилозы и сульфатирован по остаткам галактозы [2].

Дальнейший синтез заключается в последовательном присоединении гексуроновой кислоты и гексозамина [17].

По завершении синтеза линкерного района путь биосинтеза протеогликанов разветвляется. Возможно 3 альтернативных типа реакций: присоединение β-GalNAc (инициация синтеза ХС), присоединение α-GlcNAc (инициация синтеза ГС) или присоединение α-GalNAc. Эти реакции осуществляются тремя различными трансферазами. Реакция присоединения α-GalNAc к линкерному тетрасахариду нетипична для клетки и приводит к образованию пента - или гептасахарида содержащего один дисахарид ХС, который не встречается в природных протеогликанах.

Вышеупомянутые трансферазы являются важными точками контроля в биосинтезе ПГ, так как они в конечном итоге определяют тип формирующейся ГАГ-цепи [2].

Биосинтез ХС и ДС. ХС состоят из повторяющихся дисахаридных единиц GalNAc-GlcUA, полимеризованных в длинные цепи со средним размером 40 дисахаридов (~20 кДа). На основании такой структуры ХС можно предсказать, по крайней мере, 5 ферментативных активностей, включая 3 трансферазы (инициаторную GalNAc трансферазу и полимеризующие GalNAc и GlcUA трансферазы) и 2 сульфотрансферазы (GalNAc 4-сульфотрансферазу и GalNAc 6-сульфотрансферазу). Дополнительные ферменты осуществляют эпимеризацию GlcUA в IdoUA в ДС, сульфатирование С-2 уроновой кислоты и сульфатирование по другим (редко встречающимся) позициям ХС [18, 19].

После завершения синтеза углеводной цепи ХС происходит ее модификация - эпимеризация D-глюкуроновой кислоты в L-идуроновую, проводимая ферментом D-глюкуронил С5-эпимеразой (С5-EPI) и деацетилирование/сульфатирование, осуществляемое ферментом N-деацетилазой/N-сульфотрансферазой.

Эпимеризация одного или нескольких остатков GlcUA в IdoUA приводит к преобразованию ХС в ДС (рис.6).

Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

Рис.6. Реакция эпимеризации GlcUA в IdoUA

Затем сульфотрансферазы проводят сульфатирование по различным положениям (таблица 9), используя в качестве высокоэнергетического донора сульфатов PAPS (3′-фосфоаденил-5′-фосфосульфат) [20].

Таблица 9. Основные ферменты биосинтеза ХС и ДС

--------------------------------------------------
Фермент | Субстрат |
---------------------------------------------------------
β - галактозилтрансфераза-I | βGalNAcT-I | GlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser |
---------------------------------------------------------
β - глюкуронозилтрансфераза-II | βGlcAT-II | GalNAcβ1-4GlcA-. |
---------------------------------------------------------
β - галактозилтрансфераза-II | βGalNAcT-II | GlcAβ1-3GalNAc-. |
---------------------------------------------------------
D-глюкуронил С5-эпимераза | С5-EPI |

-3GalNAcβ1-GlcAb1-

|
---------------------------------------------------------
Хондроитинсульфат-4-сульфотрансфераза | CS4-ST |

-3GalNAcβ1-GlcAb1-

|
---------------------------------------------------------
Хондроитинсульфат-6-сульфотрансфераза | CS6-ST |

-3GalNAcβ1-GlcAb1-

|
---------------------------------------------------------
Дераматансульфат - 6 - сульфотрансфераза | DS6-ST |

-3GalNAcβ1-IdoAa1-

|
---------------------------------------------------------
Дерматансульфат - 2 - сульфотрансферза | DS2-ST |

-3GalNAcβ1-IdoAa1-

|
--------------------------------------------------------- --------------------------------------------------

Деградация ХС и ДС в клетках животных происходит в лизосомах, где содержится несколько экзогликолитических активностей (рис.7).

Для аналитических целей широко используются бактериальные ферменты деградации ХС и ДС: хондроитиназа АС (хондроитин АС лиаза), ЕС 4.2.2.5, из Flavobacterium heparinum, хондроитиназа АВС (хондроитин АВС лиаза), ЕС 4.2.2.4, из Proteus vulgaris. Бактериальные хондроитиназы расщепляют цепи ХС и ДС на дисахаридные единицы.

Биосинтез ГС и Ге. Углеводные цепигепарина и гепарансульфатов состоят из повторяющихся дисахаридных единицGlcNAcα1-4GlcUAβ1-4. После завершения полимеризации ГАГ-цепи ГС и Ге подвергаются серии реакций модификации, катализируемых, по крайней мере, четырьмя семействами сульфотрансфераз и одной эпимеразой [21].

Фермент GlcNAc N-деацетилаза/N-сульфотрансфераза отщепляет ацетильную группу от остатков GlcNAc и тут же присоединяет взамен ушедшей группы сульфатную, после чего образуетсяGlcNSO3. Однако некоторые деацетилированные остатки GlcN остаются несульфатированными. Затем эпимераза, схожая с аналогичным ферментом, участвующим в биосинтезе ДС, модифицирует остатки GlcUA, непосредствннно прилежащие к GlcNSO3. После этого происходит 2-O-сульфатирование образовавшейся IdoUA. Далее сульфотрансферазы добавляют сульфатные группы на 6-ОН остатков GlcN, прилежащих к уроновой кислоте. Наконец, сульфатированные остатки сахаров и эпимеры уроновой кислоты подвергаются действию 3-О-сульфотрансферазы.

Перечисленные модификации происходят лишь в определенных кластерах ГАГ-цепи. Таким образом, часть дисахаридных единиц преобразованиям не подвергается. Обычно реакции модификации идут в описанном выше порядке, однако полностью все этапа преобразований происходят не всегда. Это ведет к формированию огромной химической гетерогенности внутри модифицируемых регионов [10, 21].

Определенное расположение сульфатированных остатков и эпимеров уроновой кислоты в ГС и Ге формирует последовательности, с которыми связываются лиганды [10].

Основной вопрос, возникающий в данном случае, - каким образом регулируются ферменты и пути биосинтеза ГС/Ге, приводящие к формированию тканеспецифичных лиганд-связывающих последовательностей.

На данный момент выделены и клонированы практически все ферменты биосинтеза ГС. Обнаружено несколько важных особенностей, которые могут пролить свет на процесс возникновения лиганд-связывающих последовательностей [22].

- Некоторые ферменты имеют по 2 каталитических активности, заключенных в одном белке. Например, белок, несущий 2 каталитических домена, осуществляющих N-деацетилирование остатков GlcNAc и последующее N-сульфатирование. То же верно и для кополимеразы, переносящей GlcNAc и GlcUA с соответствующих UDP - сахаров на растущую цепь полимера. В противоположность этому, эпимераза, 2-О-сульфотрансфераза и 6-О - сульфотрансфераза (зы) являются уникальными активностями независимых белков.

- В ряде случаев существуют множественные изоферменты, катализирующие одну или пару реакций. К примеру, описаночетыре N-деацетилазы/N-сульфотрансферазы, три 6-О-сульфотрансферазы.

Их распределение в тканях различается. Это может служить причиной различий паттернов сульфатирования. Хотя наблюдается и определенное перекрывание, то есть индивидуальные изоферменты могут работать на различных последовательностях в пределах одной цепи.

- Реакции модификации полимерной цепи, вероятно, колокализуются в определенных участках аппарата Гольджи. Ферменты могут формировать супрамолекулярные комплексы, координирующие реакции модификации. Структура этих комплексов может играть роль в регуляции тонкой структуры цепи.

- Структура ГС более значительно различается между разными типами клеток, чем между коровыми белками, экспрессируемыми в одной клетке.

Этот факт свидетельствует о том, что каждый тип клеток может экспрессировать уникальный набор ферментов и регуляторных факторов [10, 22].

Подробно биосинтез ГС и Ге описан вобзоре [10].

Деградация ГС происходит в лизосомах и состоит из нескольких этапов (см. рис.7).

1.12 Обмен протеогликанов

Клетки секретируют протеогликаны в межклнеточное пространство, также часть мембранных ПГ отщепляется от клеточной поверхности протеазами, которые расщепляют коровый белок по опрелеленным сайтам.

В то же время значительные количества ПГ поглощаются клетками путем эндоцитоза (рис.7).

Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

Рис.7. Обмен протеогликанов [23].

После эндоцитоза происходит постепенная деградация ПГ в лизосомах. Поглощенные клеткой ПГ сначала подвергаются действию гепараназ, хондроитиназ, кератназ или гиалуронидаз, расщепляющих ГАГ-цепи по ограниченному числу сайтов. Затем набор экзогликозидаз и сульфатаз завершает деградацию полученных на первой стадии фрагментов [23].

1.13 Локализация и функции протеогликанов

Протеогликаны представляют собой гетерогенный класс макромолекул, отличающихся друг от друга по молекулярному весу, составу, тонкой структуре ГАГ и функциям.

Существующее огромное структурное разнообразие ПГ объясняется несколькими факторами. Во-первых, коровый белок обычно несет несколько ГАГ-акцепторных сайтов, не все из которых одинаково используются. Во-вторых, может варьировать длина ГАГ-цепей. Цепи ГАГ могут также различаться по распределению сульфатированных остатков сахаров [21, 24].

Благодаря высокому отрицательному заряду, наличию сульфатных и ацетильных групп на ГАГ-цепях, реакционных групп коровых белков, ПГ вступают во взаимодействие с различными молекулами (таблица 10).

Таблица 10. Примеры белков, взаимодействующих с ГАГ

--------------------------------------------------
Взаимодействия клетки с матриксом | Коагуляция/Фибринолиз | Липолиз | Воспаление/Рост |
---------------------------------------------------------
Ламинин | антитромбин III | липопротеин - липаза | FGF |
---------------------------------------------------------
Фибронектин | кофактор гепарина II | печеночная липаза | рецепторы |
---------------------------------------------------------
Тромбоспондин | тромбин | апоE | HGF |
---------------------------------------------------------
Коллаген I типа | ингибитор С-белка | LDL | VEGF |
---------------------------------------------------------
Коллаген III типа | tPA и PAI-1 | IL-8/MIP-1β |
---------------------------------------------------------
Коллаген V типа | TGF-β |
---------------------------------------------------------
Витронектин | L - и P-селектины |
---------------------------------------------------------
Тенаскин | супероксиддисмутаза |
--------------------------------------------------------- --------------------------------------------------

Большинство белков связывается с ГС, которые являются наиболее химически гетерогенным классом ГАГ. ГС взаимодействуют с белками специфическими участками ГАГ с определенным паттерном сульфатирования остатков сахаров [21]. Эти взаимодействия имеют глубокий физиологический эффект. Примером может служить введение в кровяное русло гепарина, приводящее к быстрому антикоагуляционному эффекту, благодаря связыванию и активации антитромбина.

Связывание ГАГ с лигандами может приводить к (1) иммобилизации белков в месте их продукции, (2) регулированию ферментативной активности, (3) присоединению к сигнальному рецептору, (4) защите лиганда от деградации, (5) резервированию лигандов [25, 26].

Протеогликаны найдены во всех исследованных тканях многоклеточных беспозвоночных и позвоночных животных

Протеогликаны известны в основном как компоненты внеклеточного матрикса, включая хрящ, базальную мембрану и соединительную ткань. Они также широко представлены на клеточной поверхности (мембранные ПГ). А также ПГ могут запасаться внутри клетки в секреторных гранулах.

Протеогликаны внеклеточного матрикса в основном содержат ДС/ХС цепи ГАГ [27], тогда как ПГ на поверхности клеток в основном представлены ГСПГ [28].

Все эпителиальные ткани экспрессируют протеогликаны клеточной поверхности, преимущественно глипиканы (ГС) и синдеканы (ГС/ХС) [29].

По локализации протеогликаны клеточной поверхности могут быть трансмембранными белками (синдеканы), могут быть связаны с липидами плазматической мембраны через фосфатидилинозитол (глипиканы) или секретироваться в базальную мембрану (перлекан, агрин). Коровый белок синдекана имеет протяженный трансмембранный домен и короткий (34-38 аминокислотных остатков) С-концевой цитоплазматический домен. Коровый белок глипикана имеет глобулярную структуру, стабилизированную дисульфидными связями, и заякорен в плазматической мембране через фосфатидилинозитол. Доказательства, что мембранные ПГ могут ферментативно высвобождаться из мембран, пока нет. Однако есть предположение, что такое высвобождение имеет место in vivo и осуществляется фосфоинозитол-специфичной фосфолипазой С. Базальные мембраны тканей млекопитающих содержат перлекан и агрин. Перлекан присутствует в большинстве базальных мембран, а также в хряще, в то время как агрин является компонентом базальных мембран в мышцах, нервномышечных соединениях, центральной нервной системе, легких и почках. Оба протеогликана являются крупными мультидоменными молекулами, несущими цепи гепарансульфатов ближе к N-концу корового белка [30].

Протеогликаны обнаружены также в ядрах, где, как установлено в ряде случаев, связаны с транскрипционно активной частью хроматина [31, 32].

Протеогликаны внеклеточного матрикса формируют его структуру за счет взаимодействий с различными внеклеточными макромолекулами. Во внеклеточном матриксе ПГ взаимодействуют с ламинином, фибронектином [33], коллагеном I [34]. Известно, что декорин связывается с коллагеном I, II [35], IX [36], причем как в эмбриональных тканях, так и в тканях взрослого человека [36]. Фибромодулин, так же как и декорин, связывается с коллагеном I и II и влияет на фибриллогенез коллагена [25, 37], тогда как бигликан коллаген не связывает, но его большое количество было обнаружено во внеклеточном матриксе мезенхимных эмбриональных клеток [36].

Показано, что аггрекан в суставных хондроцитах быка образует комплекс с гиалуроновой кислотой и связующим белком (рис.1) [38], кроме того, подобный комплекс может образовывать и другой ПГ - версикан [39]. Показано, что молекула версикана из культуры клеток ACHN взаимодействует с хемокинами [40], L - селектином [41], Р-селектином, рецептором CD44, играющим важную роль в процессах воспаления, аутоиммунном ответе, прогрессии опухолей. Связь образуется посредством взаимодействия ХС-цепи версикана с углеводсодержащим доменом L-, P-селектина, CD44 [42].

Протеогликаны поверхности клеток представляют собой рецепторы для различных компонентов внеклеточного матрикса, регуляторных макромолекул, факторов роста и играют ключевую роль в информационной связи между клеткой и внеклеточным матриксом.

На поверхности кератиноцитов обнаружен и идентифицирован эпикан - гепарансульфат протеогликан [43]; после секвенирования последовательности его корового белка было обнаружено, что он является протеогликановой (ХС) формой рецептора CD44 [44]. Показано, что это альтернативно сплайсированная форма CD44, содержащая дополнительный экзон [45].

Клетки с запасными гранулами накапливают протеогликаны наряду с другими секреторными продуктами. Эти ПГ обычно содержат высоко сульфатированные формы ХС. Исключением являются тучные клетки соединительной ткани, содержащие в секреторных гранулах преимущественно гепарин. Предполагается, что протеогликаны в секреторных гранулах способствуют удалению веществ из последних и регулируют доступность положительно заряженных компонентов, таких как протеазы и биогенные амины [46].

Показано, что протеогликаны могут связывать факторы роста и модулировать их активность [1].

Декорин, относящийся к классу дерматансульфат протеогликанов, взаимодействует с рецептором эпидермального фактора роста и запускает сигнальный каскад реакций, который приводит к торможению деления клеток [47]. Бетагликан - протеогликан, содержащий цепи ХС и ГС, - взаимодействует с трансформирующим фактором роста TGF-b [48].

Гепарансульфат протеогликаны (например, синдекан) связывают различные факторы роста, включая фактор роста фибробластов - FGF-a, FGF-b (рис.8), гранулоцитомакрофаг колониестимулирующий фактор - GM-CSF, взаимодействуют с интерлейкином - 3 и интерфероном-g [1, 27], усиливают рост и дифференцировку клетки, взаимодействуя с FGF-b [49], показан предположительный механизм связывания рецептора FGF-b с ГС [50].

Рисунок убран из работы и доступен только в оригинальном файле.

Рис.8. Взаимодействие протеогликанов с факторами роста

Таким образом, протеогликаны, помимо выполнения структурной функции, участвуют в регуляции таких фундаментальных клеточных процессов, как морфогенез, дифференцировка и клеточная пролиферация.

1.14 Состав протеогликанов в трансформированных клетках

Наличие множества связующих доменов в сложной структуре протеогликанов дает им возможность специфично взаимодействовать со множеством разнообразных регуляторных молекул.

Протеогликаны связывают в единую структуру различные компоненты внеклеточного матрикса, такие как гиалуроновая кислота, коллаген, ламинин, фибронектин; опосредуют связывание клеток с ВКМ; накапливают на своей поверхности (резервируют) факторы роста; презентируют факторы роста клеточным рецепторам; могут выступать в роли факторов клеточной адгезии, стимулируя организацию актиновых филаментов цитоскелета [51].

Из всего вышеперечисленного можно сделать вывод, что протеогликаны играют важную роль в регуляции процесса клеточной пролиферации, и нарушения в экспрессии и/или посттрансляционной модификации этих молекул могут служить одной из причин злокачественного перерождения тканей.

Показано, что в окружающей опухоль строме происходят значительные изменения в содержании протеогликанов. Предполагается, что эти изменения могут поддерживать рост опухоли, ее прогрессию и инвазию.

Уровень содержания декорина, лейцин-богатого протеогликана, участвующего в регуляции пролиферации клеток и сборки внеклеточного матрикса, значительно повышен в опухолевой строме. В то же время в опухолевых клетках экспрессия декорина значительно снижена или вообще не детектируется (см. п.1.14.1.).

При малигнизации наблюдается уменьшение уровня сульфатирования гепарансульфатов и увеличение экспрессии гиалуроновой кислоты. На поздних стадиях развития опухоли высокий уровень этого анионного полимера способствует разрыхлению окружающего матрикса, тем самым облегчая инвазию опухолевых клеток [52].

CD44 - основной рецептор для гиалуроновой кислоты на клеточной поверхности, и сам относится к классу ХСПГ. На гиалуронат-связывающую активность CD44 оказывают влияние N - и O-гликозилирование данного белка, присоединение к нему ГАГ-цепи, а также экспрессия различных изоформ CD44. Изменения в экспрессии CD44 (в том числе изменения гликоформ и изоформ) наблюдаются во многих видах злокачественных опухолей. В некоторых случаях данные изменения прямым образом коррелируют с метастатическим потенциалом [53].

Опухолевые клетки могут выделять полипептидные факторы, которые изменяют тип протеогликанов, продуцируемых хозяйской мезенхимой. Так, нормальные фибробласты, будучи помещенными в культуральную среду, на которой ранее культивировались клетки рака прямой кишки человека, начинают продуцировать необычно большое количество хондроитинсульфатов. Изменение метаболизма протеогликанов в нормальных мезенхимных клетках может являться одним из механизмов, с помощью кторого опухолевые клетки меняют окружающую их среду [54].

В опухолевых клетках изменяется количественный и качественный состав протеогликанов.

Показано, что в клетках практически всех исследованных опухолевых тканей происходит увеличение содержания протеогликанов по сравнению с нормальной тканью: в опухолевых клетках карциномы желудка происходит увеличение содержания ПГ по сравнению с нормальной тканью в два раза [55], в карциноме поджелудочной железы в 4 раза [56], в карциноме прямой кишки - в 2 раза [57].

В опухолевых клетках происходит снижение сульфатирования ГАГ: в клетках карциномы желудка в 10 раз увеличивается содержание несульфатированных дисахаридных единиц, однако происходит увеличение сульфатирования ХС и ДС цепей по 6-положению в 4 раза [55]. В клетках аденокарциномы кишечника увеличивается число несульфатированных единиц в 3 раза, в 3 раза уменьшается количество 4-сульфатированных единиц, увеличивается в 5 раз количество дисахаридных единиц, сульфатированных по 6-положению [58].

Для многих опухолей показано изменение соотношения ДС и ХС. В карциноме желудка увеличивается содержание ХС по сравнению с нормой в 4 раза [55], в карциноме поджелудочной железы содержание ХС увеличивается в 22 раза [56], в клетках карциномы гортани - в 5 раз [59], в аденокарциноме кишечника - в 11 раз [58]. Для опухоли прямой кишки показано, что содержание хондроитинсульфатов увеличивается с 27% до 70% [57], в карциноме молочной железы содержание ХС увеличивается на 32,2 % [60].

Наряду с увеличением содержания хондроитинсульфатов происходит снижение содержания дерматансульфатов, характерных для покоящихся тканей.

Для опухоли прямой кишки показано, что содержание дерматансульфатов падает с 73% до 30% [57], в карциноме молочной железы содержание ДС снижается на 18,5 % [60].

Показано, что изменяется структура ПГ в опухолевых клетках - в лейомиоме количество остатков L-идуроновой кислоты уменьшается по сравнению с нормой с 55% до 45% [61].

1.14.1 Декорин

Декорин относится к классу дерматансульфат протеогликанов и является членом семейства маленьких лейцин-богатых протеогликанов.

К коровому белку декорина ковалентно присединена одна цепь ДС или ХС.

Декорин известен как секретируемый протеогликан, экспрессируемый широким кругом тканей мезенхимального происхождения, включая опухолевую строму, но не трансформированными клетками.

Декорин участвует в регуляции таких клеточных функций, как пролиферация, адгезия и миграция.

Декорин способен связываться с компонентами внеклеточного матрикса - фибронектином, тромбоспондином и несколькими типами коллагена, регулируя фибриллогенез последнего. Коровый белок декорина взаимодействует с TGF- и является ингибитором этого цитокина. Декорин также может напрямую тормозить клеточную пролиферацию [62].

Показано, что декорин участвует в целом ряде механизмов, регулирующих пролиферацию клеток:

- взаимодействует с рецептором эпидермального фактора роста [63] (EGFR) и запускает сигнальный каскад, приводящий к увеличению экспрессии белка р21, что приводит к супрессии циклина, подавлению активности циклин-зависимых киназ [64] и торможению клеточного деления [65];

- ингибирует биологическую активность фактора роста TGF- [66]. TGF- может влиять на рост опухоли, опосредовать устойчивость к лекарствам, усиливать ангиогенез в опухоли [67]. Декорин присоединяется к связывающему домену TGF-, предотвращая его связывание с рецептором, что приводит к торможению клеточного деления [68];

- подавляет экспрессию и биосинтез эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF), что приводит к супрессии ангиогенеза в опухолевой ткани [69];

- вызывает функциональную инактивацию онкогенного белка ErbB2, ингибируя тем самым рост клеток и стимулируя их дифференцировку [68];

- влияет на жизнеспособность клеток через Akt/протеинкиназа В-зависимый и - независимый механизмы, снижая апоптоз эндотелиальных клеток [70].

Для декорина доказана антимитотическая активность: добавление рекомбинантного декорина в культуру опухолевых клеток ингибировало их рост in vitro [71], экспрессия декорина de novo в культуре опухолевых клеток приводила к их возвращению к нормальному фенотипу [72]. Аденовирусная доставка декорина в растущую экспериментальную опухоль приводила к значительному ингибированию роста опухоли [73].

Целью описанных выше экспериментов являлось введение в опухолевую ткань недостающего декорина в той или иной форме (рекомбинантного белка либо генноинженерных конструкций).

Однако вопрос о причине снижения содержания декорина в трансформированных клетках до сих пор не поднимался.

1.14.2 D-глюкуронил С5-эпимераза

Известно, что ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфат протеогликанов (в том числе и декорина) является фермент D-глюкуронил С5-эпимераза [74]. Этот фермент проводит эпимеризацию глюкуроновой кислоты в идуроновую (рис.6) с образованием функционально активного декорина. Причем в экспериментах in vitro было показано, что этот процесс может быть обратимым [75], однако, после полной модификации ГАГ цепи обратная реакция невозможна [76].

Показана субстратная специфичность для D-глюкуронил С5-эпимеразы, выделенной из культуры клеток фибробластов - дерматан и хондроитин являются хорошими субстратами для этого фермента, тогда как их О-сульфатированные формы практически не подвергаются модификации [77]. Вероятно, эпимеризация уроновой кислоты в идуроновую происходит до О-сульфатирования ГАГ, и О-сульфатированные ГАГ не являются субстратом для D-глюкуронил С5-эпимеразы [78].

Известно, что для работы D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши необходимы N-ацетильные группы на глюкозамине и определенное расположение N-сульфатных групп. Кроме того, существует прямая зависимость работы фермента от размера субстрата [79].

Процесс эпимеризации остатков глюкуроновой кислоты в идуроновую кислоту зависит от структуры корового белка [80].

Биосинтез протеогликанов изучен достаточно хорошо, большинство ферментов их биосинтеза клонированы. D-глюкуронил С5-эпимераза является единственным ферментом биосинтеза протеогликанов человека, который до сих пор не клонирован [17].

В настоящее время клонированы и охарактеризованы гены D-глюкуронил С5-эпимеразы быка [81] и мыши [82] - единственный ген D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши находится в 9 хромосоме. Показано, что мышиная D-глюкуронил С5-эпимераза приблизительно одинаково экспрессируется в различных тканях: сердце, мозге, легких, печени, мышцах, почках. Исключением является селезенка, в которой экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы понижена [82].

Показано, что разрушение гена, кодирующего D-глюкуронил С5-эпимеразу у мыши, приводило к гибели эмбриона (гетерозиготы погибали в течение года, гомозиготы по мутантному генотипу погибали сразу после рождения). У эмбрионов были обнаружены дефекты развития почек, легких, неправильное формирование скелета. В других жизненно важных органах и системах (мозге, печени, желудочно-кишечном тракте, коже) изменений обнаружено не было. Оказалось, что присутствие идуроновой кислоты необходимо для нормального развития почек, легких, скелета [83]. Также показано, что наличие ГС, содержащих остатки идуроновой кислоты необходимо для нормального развития различных типов нейронов [84].

Отсутствие публикаций по данным вопросам не позволяет сказать, есть ли какая-либо ткане - или видоспецифичность в экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы у человека и одинаковы ли экспрессия/активность этого фермента в нормальных и опухолевых тканях, существует ли связь между изменением состава ПГ и изменением экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы.

Регуляторная роль протеогликанов изучалась в лаборатории Структуры генома ИЦиГ СО РАН в течение ряда лет. Исследовались протеогликаны из различных типов клеток, был охарактеризован их состав и структурные особенности. В работах В. И. Рыковой и

Г. М. Роничевской с соавторами была показана антимитотическая активность ПГ, выделенных из препаратов суммарной клеточной РНК [85] и их влияние на синтез ДНК в клетке [31]. Изучался также состав протеогликанов в ядрах нормальных и трансформированных клеток [32]. Было показано, что при злокачественной трансформации в клетках снижается содержание дерматансульфат протеогликанов и возрастает содержание хондроитинсульфат протеогликанов - не полностью модифицированных предшественников ДСПГ [32]. Данные эксперименты велись на животных.

Поскольку ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфатов в клетке является D - глюкуронил С5-эпимераза [74], то нашей группой было выдвинуто предположение, что причиной недостаточного синтеза дерматансульфат протеогликанов в клетках является пониженная экспрессия/активность фермента D-глюкуронил С5-эпимеразы.

В настоящее время в лаборатории Молекулярных механизмов канцерогенеза Института Молекулярной Биологии и Биофизики СО РАМН совместно с лабораторией Структуры генома ИЦиГ СОРАН ведется изучение взаимосвязи между уровнем экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы и составом протеогликанов в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.

В рамках данного исследования в лаборатории Молекулярных механизмов канцерогенеза ведется работа по определению уровня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека методами мультиплексной ПЦР и ПЦР в реальном времени.

Целью данной дипломной работы является изучение взаимосвязи состава протеогликанов в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека с экспрессией белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы.

В соответствии с этой целью нами были поставлены следующие задачи:

1.  Сравнить состав протеогликанов в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека;

2.  Провести количественную оценку суммарных протеогликанов в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека;

3.  Определить экспрессию дерматансульфат протеогликана декорина в контрольной опухолевой ткани молочной железы человека;

4.  Определить экспрессию белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы в тех же клинических образцах.


Глава 2. Материалы и методы 2.1 Материалы

В работе использовались следующие материалы и реактивы:

трис, агароза - “ICN” (США);

хлорид магния, ацетат натрия - “Merck” (Германия);

персульфат аммония, SDS, акриламид, реактив Брэдфорда Quick Start Bradford Dye Reagent, набор стандартных концентраций бычьего сывороточного альбумина Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Set, маркер “Калейдоскоп” - “BioRad" (США);

набор ECL Western Blotting Analysis System - “Amersham Biosciences" (Великобритания);

ингибиторный коктейль Protease Inhibitor Coctail Tablets - “Roche Diagnostics" (Германия);

ЭДТА, бромфеноловый синий, кумасси G250, рибонуклеаза А (РНКаза А),

N, N’-метиленбисакриламид - “Serva” (Германия);

набор реактивов Рентген-2: проявитель рентгеновских материалов типа РМ-1 и РФ-3, фиксаж нейтральный - химзавод им. Л.Я. Карпова (Менделеевск, Татарстан);

глицин, твин-20, PBS Tablets - “Helicon” (Россия, Москва);

N-лаурилсаркозин (натриевая соль), IGEPAL CA-630 - “SIGMA” (США);

алциановый голубой - “Loba-Chemie” (Австрия);

альбумин лиофилизированный из человеческой сыворотки, TEMED - “ Reanal ” (Венгрия);

буфер для нанесения проб NuPage SDS Sample Buffer (x4) - “Invitrogen" (CША).

Специфические ферменты деградации ГАГ:

хондроитиназа АС (хондроитин АС лиаза), ЕС 4.2.2.5, из Flavobacterium heparinum,

хондроитиназа АВС (хондроитин АВС лиаза), ЕС 4.2.2.4, из Proteus vulgaris - “SIGMA” (США).

Стандарты ГАГ:

гепарин - “Richter” (Венгрия);

хондроитинсульфат А (натриевая соль) из хряща кита,

хондроитинсульфат В (натриевая соль) из кожи свиньи,

хондроитинсульфат С (натриевая соль) из хряща акулы - “SIGMA” (США).

Антитела:

D-глюкуронил С5-эпиме

Здесь опубликована для ознакомления часть дипломной работы "Нарушение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможная причина изменения структуры протеогликанов в опухоли молочной железы человека". Эта работа найдена в открытых источниках Интернет. А это значит, что если попытаться её защитить, то она 100% не пройдёт проверку российских ВУЗов на плагиат и её не примет ваш руководитель дипломной работы!
Если у вас нет возможности самостоятельно написать дипломную - закажите её написание опытному автору»


Просмотров: 529

Другие дипломные работы по специальности "Медицина, здоровье":

Маркетинговый анализ ассортимента лекарственных средств в педиатрии

Смотреть работу >>

Восемь методов успокоиться

Смотреть работу >>

Нарушения осанки у юношей и их коррекция средствами физической культуры

Смотреть работу >>

Варикозная болезнь голени и бедра

Смотреть работу >>

Отчет о работе медицинской сестры

Смотреть работу >>